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在现有培养雨生红球藻的方法中，游动细胞阶段和不动孢子阶段在同一个反应器中进行，且并不对雨生红球藻游动细胞进行分离，究其原因主要是：考虑到雨生红球藻游动细胞的形态和存活特性，本领域技术人员普遍认为根本无法对游动细胞阶段的雨生红球藻进行分离，且一旦对游动细胞阶段的雨 生红球藻进行分离则极有可能伤害雨生红球藻游动细胞甚至会影响雨生红球藻游动细胞的存活，而本发明的发明人在研究中意外发现，可以将雨生红球藻游动细胞进行过滤分离或者重力沉降分离，然后在不同的反应器中进行不动孢子阶段的培养，该养殖过程不仅不会对雨生红球藻游动细胞造成伤害，而且操作稳定，质量控制容易，且在养殖过程中所有培养液都可以回收利用，养殖成本低且不会产生废液排放和环境污染的问题。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种雨生红球藻的养殖方法，该方法包括：

(1)进行雨生红球藻游动细胞阶段的培养；

(2)当培养至藻液的OD680值为0.01-10时，将至少部分藻液进行分离，得到分离清液I和雨生红球藻游动细胞，将分离清液I返回至步骤(1)中回用；

(3)将步骤(2)得到的雨生红球藻游动细胞进行不动孢子阶段的培养；

(4)待培养至完全转红后进行分离，得到分离清液II和雨生红球藻不动孢子，将分离清液II返回至步骤(3)中回用；

(5)将雨生红球藻不动孢子进行干燥得到雨生红球藻产品；

步骤(2)中，所述分离的方式为过滤分离或者重力沉降分离。

本发明的方法能够实现雨生红球藻游动细胞的连续养殖，进而实现雨生红球藻不动孢子的半连续养殖，养殖过程操作稳定，质量控制容易，且在养殖过程中所有培养液都可以回收利用，养殖成本低且不会产生废液排放和环境污染的问题。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种雨生红球藻的养殖方法，所述方法包括：

(1)进行雨生红球藻游动细胞阶段的培养；

(2)当培养至藻液的OD680值为0.01-10时，将至少部分藻液进行分离，得到分离清液I和雨生红球藻游动细胞，将分离清液I返回至步骤(1)中回用；

(3)将步骤(2)得到的雨生红球藻游动细胞进行不动孢子阶段的培养；

(4)待培养至完全转红后进行分离，得到分离清液II和雨生红球藻不动孢子，将分离清液II返回至步骤(3)中回用；

(5)将雨生红球藻不动孢子进行干燥得到雨生红球藻产品；

步骤(2)中，所述分离的方式为过滤分离或者重力沉降分离。

本发明方法中，优选情况下，步骤(1)在游动细胞养殖器中进行，游动细胞养殖器为开放式光生物反应器或封闭式光生物反应器。 对于开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器。 例如开放式光生物反应器可以为跑道式光生物反应器或箱体式光生物反应器；开放式光生物反应器的材质可以为金属、水泥、无机玻璃、有机玻璃或塑料，塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。 优选地，开放式光生物反应器为透明聚丙烯箱体或水泥池。 封闭式光生物反应器可以为鼓泡式光生物反应器、气升式光生物反应器、搅拌式光生物反应器等；封闭式光生物反应器的材质可以为无机玻璃、有机玻璃或透明塑料，透明塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。 优选地，封闭式光生物反应器为自清洁的鼓泡式聚氯乙烯光生物反应器。

本发明方法中，对于雨生红球藻藻种和培养液没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种雨生红球藻藻种和培养液，此为本领域技术人员所公 知，在此不再赘述。

本发明方法中，本领域技术人员应该理解的是，在实际的雨生红球藻培养过程中，培养温度、光照强度和培养液的pH值往往无法控制在一个精确的点值，而是在一个范围内进行波动。 优选情况下，步骤(1)中，培养的条件包括：温度为15-25℃，光照强度为1000-5000Lux，pH值为6-8。 其中，培养的条件还包括：在培养过程中通入的碳源为含有二氧化碳的气体，气体中二氧化碳的含量为1-20重量％，优选为2-10重量％，进一步优选为3-8重量％。 在进行光照时，光源可以为自然光，也可以为人造光源(如LED光源)，优选为自然光。 含有二氧化碳的气体可以为高纯二氧化碳或工业过程排放的含有二氧化碳的气体，工业过程排放的含有二氧化碳的气体可以包括电厂和炼厂排放的含有二氧化碳的气体。 优选地，含有二氧化碳的气体为高纯二氧化碳或者炼厂制氢尾气。 本领域技术人员应该理解的是，含有二氧化碳的气体在进入到游动细胞养殖器前需进行净化除去固体颗粒物并进行冷却。

本发明方法中，优选情况下，步骤(2)中，培养至藻液的OD680值为0.05-5，进一步优选为0.1-1。

本发明方法中，优选情况下，步骤(2)中，至少部分藻液占全部藻液体积的20-50％。

本发明方法中，优选情况下，步骤(2)中，将至少部分藻液转移至分离与储运装置中进行分离。 对于转移的方式没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种转移的方式。 其中，转移的方式优选为重力转移、溢流转移或者虹吸转移，进一步优选为溢流转移。

本发明方法中，优选情况下，步骤(2)中，分离的方式为过滤分离。 过滤分离的方式可以为常压过滤分离、加压过滤分离和真空过滤分离，进一步优选为常压过滤分离。

本发明方法中，优选情况下，分离与储运装置为圆柱形分离空塔，所述 圆柱形分离空塔的高径比为1-10:1，进一步优选为1.5-5:1，且所述圆柱形分离空塔的底部安装有过滤介质。 对于过滤介质没有特别的限定，可以为本领域常用的各种过滤介质，优选情况下，过滤介质为玻砂、滤布或滤纸，进一步优选为玻砂；过滤介质的孔径为1-60μm，进一步优选为10-30μm。

本发明方法中，优选情况下，圆柱形分离空塔设置有搅拌器，进一步优选地，搅拌器为锚式搅拌器、框式搅拌器或螺带式搅拌器，更进一步优选为框式搅拌器。

本发明方法中，本领域技术人员应该理解的是，分离与储运装置的数目视游动细胞养殖器和不动孢子养殖器的体积而定，可以是1个，也可以是多个并联操作。

本发明方法中，优选情况下，将分离清液I返回至步骤(1)中回用的方式包括：将分离清液I与补充的(新鲜的)培养液在介质罐中混合后返回至游动细胞养殖器。

本发明方法中，优选情况下，步骤(3)在不动孢子养殖器中进行，不动孢子养殖器为开放式光生物反应器或封闭式光生物反应器，优选为开放式光生物反应器。 对于开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器。 例如开放式光生物反应器可以为跑道式光生物反应器或箱体式光生物反应器；开放式光生物反应器的材质可以为金属、水泥、无机玻璃、有机玻璃或塑料，塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。 优选地，开放式光生物反应器为透明聚丙烯箱体或水泥池。 封闭式光生物反应器可以为鼓泡式光生物反应器、气升式光生物反应器、搅拌式光生物反应器等；封闭式光生物反应器的材质可以为无机玻璃、有机玻璃或透明塑料，透明塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。

本发明方法中，优选情况下，步骤(3)中，雨生红球藻游动细胞与分 离清液II在分离与储运装置中混合后转移至不动孢子养殖器中进行不动孢子阶段的培养。 进一步优选地，转移至不动孢子养殖器中的方式为虹吸转移或真空转移，更进一步优选为真空转移。

本发明方法中，对于胁迫雨生红球藻积累油脂和虾青素的方式没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方式。 例如，步骤(3)中，培养的方式可以为温度胁迫培养、光照胁迫培养或者胁迫剂胁迫培养。 优选地，培养的方式为胁迫剂胁迫培养。 进一步优选地，胁迫剂胁迫培养的条件包括：pH值为7-9，温度为24-30℃，光照强度为5000-15000Lux，胁迫剂为钠盐，且以每升混合藻液计，胁迫剂的加入量为每升培养液0.005-0.05mol，更进一步优选为0.02-0.05mol；再更进一步优选地，胁迫剂为碳酸氢钠。

本发明方法中，本领域技术人员应该理解的是，不动孢子养殖器的数目应与游动细胞养殖器中游动细胞红球藻的生长周期、采收周期、采收数量、不动孢子红球藻积累油脂和虾青素的生长周期相匹配，可以是1个，也可以是多个并联操作，优选为2-5个。

本发明方法中，优选情况下，步骤(3)中，转移结束后，用去离子水清洗分离与储运装置至中性以进行下次分离和转移，并将清洗液储存备用。 例如可以将清洗液送至清液罐中储存备用。

本发明方法中，优选情况下，将清洗液回用至步骤(3)中，进一步优选地，回用的方式包括：将清洗液与雨生红球藻游动细胞在分离与储运装置中混合后转移至不动孢子养殖器中进行不动孢子阶段的培养；或者回用的方式包括：在不动孢子阶段的培养中，将清洗液转移至不动孢子养殖器中用于补充水分。

本发明方法中，本领域技术人员应该理解的是，步骤(4)中，可以通过光学显微镜观察不动孢子的转红状态，当不动孢子从周边到中心均变为红色时进行分离。

本发明方法中，优选情况下，步骤(4)中，分离的方式为离心分离、过滤分离或重力沉降分离，进一步优选为重力沉降分离。

本发明方法中，优选情况下，将分离清液II返回至步骤(3)中回用的方式包括：将分离清液II通过泵输送到分离与储运装置，同分离出的雨生红球藻游动细胞混合均匀。 进一步优选地，通过离心泵输送分离清液II。 本领域技术人员可以理解的是，为了方便分离清液II的回用，可以将分离清液II先储存于清液罐中备用。

本发明方法中，步骤(5)中，可以先将雨生红球藻不动孢子送至浓缩罐中再进行干燥。 对于干燥的方式没有特别的限定，可以为本领域常用的各种干燥方式，优选情况下，干燥的方式为自然干燥、真空干燥或喷雾干燥，进一步优选为旋风喷雾干燥。

实施例

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明不仅限于此。

雨生红球藻购自中科院武汉水生生物研究所。

藻液的光密度值(OD值)测定：光密度值用分光光度计测定，以蒸馏水作对照，测定藻液在波长680nm处的吸光值，作为藻液浓度的指标。

培养时使用BG11培养基，培养基成份见表1-表2，在BG11培养基中NaNO3为氮源。

表1BG11培养基

组分含量，mg/LK2HPO4·3H2O40NaNO31500Na2CO320MgSO4·7H2O75

CaCl2·2H2O36柠檬酸6柠檬酸铁铵6EDTA-2Na1微量元素A51

表2微量元素A5

组分组成，mg/LH3BO32860MnCl2·4H2O1810ZnSO4·7H2O222CuSO4·5H2O79NaMoO4·5H2O390Co(NO3)2·6H2O50

炼厂制氢尾气为中国石化公司石家庄炼化分公司的炼厂制氢尾气，二氧化碳的含量为20-25重量％，使用前进行净化除去固体颗粒物并进行冷却。 冷却至25℃后与空气混合形成混合气体，使得混合气体中二氧化碳含量为6重量％，在雨生红球藻培养过程中通过控制混合气体的进气流量控制pH值。

封闭式光生物反应器为聚氯乙烯薄膜袋，直径为220mm、高为1500mm、容积为35L，无内导流筒。

开放式光生物反应器为透明聚丙烯箱体，容积为20L，受光面积为0.095m2。

雨生红球藻的养殖速率(g/m2/d)＝雨生红球藻干重/雨生红球藻游动细胞培养阶段的受光面积/雨生红球藻游动细胞培养阶段的养殖时间。

分离与储运装置为一个30L的底部带有玻砂过滤介质的有机玻璃圆柱形分离空塔，高径比为2:1，框式搅拌，带有从顶部插入到底部的输送管，并与不动孢子养殖器连接，输送管的直径为10mm，玻砂的规格为G3，孔径为15-30μm。

实施例1

本实施例用于说明利用封闭式光生物反应器养殖雨生红球藻的方法。

本实施例中，游动细胞养殖器和不动孢子养殖器均为封闭式光生物反应器。

(1)雨生红球藻的一级培养

将雨生红球藻藻种接种到装有1000mL BG11培养基的2000mL三角瓶中，接种雨生红球藻藻种后培养液的OD680值为0.015。 在20-22℃、1800-2200Lux、pH值6-7下培养藻液至OD值为0.3，备用。 培养过程中pH值由高纯二氧化碳调节。

(2)在1个封闭式光生物反应器中进行雨生红球藻游动细胞阶段的培养：封闭式光生物反应器消毒后加入28L BG11培养基和一级培养的雨生红球藻藻种，培养液的初始OD680值为0.08。 混合气体从封闭式光生物反应器底部通过气石分散以鼓泡形式进入，并产生搅动、混合，进气流量为200L/h。 在20-24℃、光照强度1800-5000Lux、pH值6-8下培养，pH值通过混合气体的进气流量控制。

(3)雨生红球藻游动细胞分离与转移：培养7天后培养液的OD680值达到0.3，通过溢流转移的方式将8.4L雨生红球藻藻液从步骤(2)的封闭式光生物反应器中转移至分离与储运装置。 经过玻砂过滤，得到分离清液I和雨生红球藻游动细胞，分离清液I进入培养液介质罐中与补充的培养基混合，经过泵输入步骤(2)的封闭式光生物反应器中使得封闭式光生物反应 器内培养液的体积为28L，继续雨生红球藻游动细胞阶段的培养。 8.4L液体由清液罐经泵送入分离与储运装置，与过滤得到的雨生红球藻游动细胞混合。 混合均匀后抽真空，混合液经过输送管进入不动孢子养殖器。

(4)分离与储运装置洗涤：真空转移结束后，加入去离子水清洗分离与储运装置至中性，清洗液进入清液罐备用。

(5)在2个并联的不动孢子养殖器，即封闭式光生物反应器中进行雨生红球藻不动孢子转化、油脂和虾青素的积累：混合液真空转移至第1个封闭式光生物反应器后，以每升混合藻液计，加入0.02mol胁迫剂碳酸氢钠，进行不动孢子转化、油脂和虾青素的积累。 培养时温度为28-32℃，光照强度为5000-15000Lux，pH值为7-9。 混合气体从封闭式光生物反应器底部通过气石分散以鼓泡形式进入，并产生搅动、混合，混合气体的进气量为60L/h，pH值通过混合气体的进气流量控制。

培养10天后在光学显微镜下观察，不动孢子从周边到中心均变为红色，停止进气，静置分离，得到分离清液II和雨生红球藻不动孢子，分离清液II进入清液罐，雨生红球藻不动孢子进入浓缩罐并经过旋风喷雾干燥后得到雨生红球藻藻粉。

待步骤(3)中用于雨生红球藻游动细胞阶段培养的封闭式光生物反应器中培养液的OD680值达到0.3时，重复步骤(3)将混合液转移至第2个不动孢子养殖器，即第2个封闭式光生物反应器。 依次循环。

按雨生红球藻游动细胞培养阶段的培养液的总体积计，雨生红球藻的养殖速率为3g/m2/d，得到的雨生红球藻中油脂的含量为36％，虾青素的含量为1.5％。

实施例2

本实施例用于说明利用开放式光生物反应器养殖雨生红球藻的方法。

本实施例中，游动细胞养殖器和不动孢子养殖器均为开放式光生物反应器。

(1)雨生红球藻的一级培养

将雨生红球藻藻种接种到装有1000mL BG11培养基的2000mL三角瓶中，接种雨生红球藻藻种后培养液的OD680值为0.015。 在20-22℃、1800-2200Lux、pH值6-7下培养藻液至OD值为0.3，备用。 培养过程中pH值由高纯二氧化碳调节。

(2)在1个开放式光生物反应器中进行雨生红球藻游动细胞阶段的培养：在开放式光生物反应器中加入16L BG11培养基和一级培养的雨生红球藻藻种，培养液的初始OD680值为0.03。 混合气体通过气石分散以鼓泡形式进入光生物反应器，并产生搅动、混合，进气流量为80L/h。 在22-25℃、光照强度1800-5000Lux、pH值6-8下培养，pH值通过混合气体的进气流量控制。