革兰氏染色法的原理是革兰氏阳性菌和阴性菌在化学和生理性质上差别比较大，染色体的反应也不一样，一般阳性菌和碘和结晶紫的复合物结合比较牢固，不容易脱色，而阴性菌的结合相对比较弱，容易脱色，这是导致染色反应的主要依据。

细菌经过碱性燃料结晶紫染色，后经过碘液进行媒染，然后用酒精脱色，在一定的条件下，有的细菌媒染后，颜色不被脱去，有的会被脱去，因此会把细菌分成两类，不被脱去的被称为革兰氏阳性菌，脱去的则被称之为革兰氏阴性菌。 脱色后可以在用红色染料进行复染，阳性菌是紫色，阴性菌则被重新染上了红色。 很多有芽孢的杆菌和大部分的球菌，还有放射菌以及真菌杜辉呈现革兰氏正反应，而弧菌、螺旋体以及大多数的致病性无芽孢杆菌则呈现出副反应。